CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein）系統(tǒng)是一種源于細(xì)菌和古細(xì)菌的抗病毒獲得性免疫機(jī)制。CRISPR/Cas系統(tǒng)以RNA蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式發(fā)揮免疫作用，其中效應(yīng)蛋白包括Cas9，Cas12a，Cas12b，CasX等。經(jīng)科學(xué)家改造將crRNA和tracrRNA合二為一形成單鏈引導(dǎo)RNA（guide RNA，gRNA）。Cas蛋白首先識(shí)別基因組上的PAM(Protospacer adjacement motif)序列，然后gRNA 特異性識(shí)別并與靶位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)，從而激活Cas蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的功能切割DNA雙鏈，實(shí)現(xiàn)特定位點(diǎn)的基因編輯。自開(kāi)發(fā)成為有效的基因編輯工具以來(lái)在各種生物體中得到了廣泛的應(yīng)用，來(lái)自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes, Sp)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是其中應(yīng)用最廣泛的基因編輯工具。然而，由于人類(lèi)遺傳變異多為點(diǎn)突變、插入或缺失，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)同源重組的方式實(shí)現(xiàn)精確的堿基修復(fù)的效率低下，且在修復(fù)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致雙鏈損傷引發(fā)脫靶風(fēng)險(xiǎn)，限制了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在精確的堿基修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用 (Science 2012; Science 2013; Cell 2017; Nature Biotechnology 2020)。
在Cas9 H840A切口酶(Cas9n-H840A切口酶)的C端融合逆轉(zhuǎn)錄酶，并在向?qū)NA(sgRNA)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，使其包含一段誘導(dǎo)目標(biāo)堿基突變的RT模板以及引物結(jié)合位點(diǎn)(primer binding site，PBS)，從而構(gòu)建得到引導(dǎo)編輯技術(shù)的向?qū)NA(prime editing guide RNA，pegRNA，獲得目標(biāo)Prime editing（PE）系統(tǒng)。PE系統(tǒng)通過(guò)pegRNA靶向基因組內(nèi)特定位點(diǎn)，而被Cas9n-H840A切口酶切斷的非互補(bǔ)鏈與pegRNA攜帶的PBS結(jié)構(gòu)結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，利用逆轉(zhuǎn)錄模板（RT template）進(jìn)行修復(fù)，從而在靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)特定堿基的轉(zhuǎn)換、插入和缺失 (Nature 2019)。
但由于PE編輯系統(tǒng)的蛋白編碼序列長(zhǎng)達(dá)6.2kb，因此無(wú)法高效地裝載到單個(gè)裝載容量?jī)H為4.7kb腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV），進(jìn)而限制其在體內(nèi)治療研究。因此克服AAV病毒的承載能力限制，體內(nèi)呈遞高活性的引導(dǎo)編輯器是目前亟待解決的難題 (Nature 2019; Nature Reviews Genetics 2020)。
為解決該難題，我校生命科學(xué)學(xué)院黃軍就教授課題組將PE科學(xué)地拆分至兩個(gè)不同的AAV上，通過(guò)內(nèi)含肽（intein）使它們能在細(xì)胞內(nèi)重新合并成全長(zhǎng)具有功能的PE蛋白，構(gòu)建雙AAV介導(dǎo)的Split-PE系統(tǒng)。首先在體外成功篩選出具有高活性的Split-PE1024變體, 并通過(guò)雙AAV8分別包裝split-PE1024的N端和C端(分別帶有pegRNA和gRNA)，通過(guò)視網(wǎng)膜下腔注射在視網(wǎng)膜區(qū)域?qū)崿F(xiàn)靶基因Dnmt1 (p.P55Q, c.G164T)的堿基顛換。通過(guò)深度測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)的編輯效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMV啟動(dòng)子和EF1α核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的split-PE1024都成功在視網(wǎng)膜Dnmt1基因位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)+5 G-to-T的堿基顛換。
圖1：雙AAV介導(dǎo)Split-PE1024誘導(dǎo)小鼠眼底視網(wǎng)膜點(diǎn)突變
研究成果“Dual-AAV delivering split prime editor system for in vivo genome editing”近期發(fā)表在Molecular Therapy雜志。該研究構(gòu)建的雙AAV介導(dǎo)的Split-PE系統(tǒng)成功在小鼠視網(wǎng)膜實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的體內(nèi)編輯，為遺傳病的體內(nèi)治療提供有效的工具。
我校生命科學(xué)學(xué)院黃軍就教授和梁普平副教授為該論文的共同通訊作者，博士生支勝堯和陳昱僖博士為論文共同第一作者。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。
