中大新聞網(wǎng)訊（通訊員楊建華）RNA除了用來(lái)合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼之外，還嵌入了第二層遺傳信息—即RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)和序列基序1。因此，揭示具有特定結(jié)構(gòu)和序列基序（motif）的新類(lèi)型非編碼RNA (ncRNA) 及其功能機(jī)制是理解細(xì)胞遺傳信息傳遞的核心任務(wù)之一。NcRNA通常通過(guò)不同的二級(jí)或三級(jí)RNA結(jié)構(gòu)基序與 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 相互作用去執(zhí)行調(diào)控功能。其中，Kink-turn (K-turn) 結(jié)構(gòu)是一類(lèi)幾乎存在所有生物中的三級(jí)（3D）RNA結(jié)構(gòu)基序，并廣泛存在于mRNA與各類(lèi)ncRNA中。K-turn結(jié)構(gòu)及其結(jié)合蛋白15.5K在RNA代謝和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。然而由于目前缺乏有效的實(shí)驗(yàn)與計(jì)算機(jī)技術(shù)去鑒定具有K-turn結(jié)構(gòu)的RNA（ktRNA），因此K-turn結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄組中的分布、表達(dá)、結(jié)構(gòu)特性及功能機(jī)制都有待全面闡釋。
中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的楊建華和屈良鵠教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了RIP-PEN-seq/PEN-seq/sub-PEN-seq等測(cè)序技術(shù)和kturnSeeker算法發(fā)現(xiàn)在固定位置出現(xiàn)后向（backward）K-turn結(jié)構(gòu)和序列基序的新類(lèi)型ncRNA（bktRNA），并解析了它們的表達(dá)、折疊結(jié)構(gòu)特性及其在RNA剪接和修飾中的功能機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的ktRNA/ncRNA及其功能機(jī)制研究提供了新方法和新思路。
由于目前的RIP-seq和RNA-seq方法經(jīng)常對(duì)長(zhǎng)度大于50個(gè)核苷酸（nt）的RNA進(jìn)行片段化及利用隨機(jī)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后測(cè)序，從而導(dǎo)致這些方法無(wú)法測(cè)定全長(zhǎng)的ncRNA和無(wú)法發(fā)現(xiàn) ncRNA 上的序列和結(jié)構(gòu)基序及其距離RNA末端的精確位置。針對(duì)這些問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)開(kāi)發(fā)RIP-PEN-seq技術(shù)去測(cè)定人和小鼠中與15.5K蛋白互作的全長(zhǎng)ncRNA分子（20-500個(gè)核苷酸），并進(jìn)一步根據(jù)K-turn結(jié)構(gòu)特性開(kāi)發(fā)了kturnSeeker算法分析這些RIP-PEN-seq測(cè)序數(shù)據(jù)（圖1）。kturnSeeker軟件除了鑒定絕大多數(shù)已知的前向（forward） ktRNA（fktRNA）和600多個(gè)新的fktRNA，還發(fā)現(xiàn)390多個(gè)新的后向ktRNA。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)和基序富集分析這些新的后向ktRNA，發(fā)現(xiàn)它們都具有以下的規(guī)律性特征：（1）具有后向K-turn結(jié)構(gòu)基序；（2）后向K-turn結(jié)構(gòu)基序具有距離這些ktRNA的5'端4個(gè)核苷酸和3'端2個(gè)核苷酸的規(guī)律；（3）后向K-turn結(jié)構(gòu)的5'端包含了CUGA及3'端包含了UGAUG的保守基序。應(yīng)用RIP-PEN-seq和kturnSeeker于小鼠的細(xì)胞同樣發(fā)現(xiàn)以上的規(guī)律性特征。此外，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步聯(lián)合了RIP-PEN-seq和SHAPE-MaP等技術(shù)發(fā)展了RIP-PEN-SHAPE-MaP方法證實(shí)了后向ktRNA的確是以這3個(gè)結(jié)構(gòu)和序列特征形成K-turn并與15.5K蛋白互作。因此基于這些規(guī)律性特征，它們被命名為具有規(guī)律性后向K-turn結(jié)構(gòu)基序的新類(lèi)型ncRNA（bktRNA）。
圖1 開(kāi)發(fā)新的RIP-PEN-seq測(cè)序技術(shù)和計(jì)算機(jī)算法kturnSeeker發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的bktRNA
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)PEN-seq和sub-PEN-seq技術(shù)應(yīng)用于人類(lèi)各種細(xì)胞和亞細(xì)胞組分，并利用kturnSeeker分析這些和公共的測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定了超過(guò)390個(gè)bktRNA，發(fā)現(xiàn)它們的長(zhǎng)度范圍從20到500個(gè)核苷酸，具有一定的組織細(xì)胞特異性，且主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。基于基因組結(jié)構(gòu)和序列保守性分析，發(fā)現(xiàn)bktRNA主要位于各種基因的內(nèi)含子區(qū)域；部分bktRNA在進(jìn)化上是很保守的（bktRNA1從人到斑馬魚(yú)保守），但有很多人類(lèi)的bktRNA只在靈長(zhǎng)類(lèi)保守。通過(guò)對(duì)bktRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)折疊（folding）特性分析發(fā)現(xiàn)它們與其它依賴(lài)金屬離子折疊的ktRNA明顯不一樣，bktRNA的序列組成及其與15.5K蛋白的互作可能共同決定了其折疊成穩(wěn)定的后向K-turn結(jié)構(gòu)。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析保守的bktRNA1基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的共進(jìn)化和SHAPE信號(hào)值，發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)由后向K-turn結(jié)構(gòu)基序與box H/ACA snoRNA (SNORA12)構(gòu)成的嵌合ncRNA分子 （圖2）。在不同細(xì)胞類(lèi)型中的亞細(xì)胞定位分析都發(fā)現(xiàn)bktRNA1主要存在于Cajal Body中。同時(shí)，通過(guò)刪除和突變bktRNA1的后向K-turn結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)后向K-turn結(jié)構(gòu)基序?qū)τ赽ktRNA1的加工、成熟及穩(wěn)定存在是必不可少的。
圖2 進(jìn)化保守的bktRNA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其折疊特征信號(hào)
為了研究這些bktRNA在體內(nèi)可能靶向哪些RNA而發(fā)揮調(diào)控功能，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)15.5K蛋白的CLASH測(cè)序，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化保守bktRNA1在細(xì)胞內(nèi)與minor splicesome（次要剪接體）中的U12 snRNA形成14個(gè)堿基的互補(bǔ)配對(duì)。分析RNA-RNA互作的PARIS測(cè)序數(shù)據(jù)也證明bktRNA1與U12 snRNA形成這個(gè)長(zhǎng)互補(bǔ)配對(duì)。由于U12上的配對(duì)區(qū)域具有2'-O-甲基化修飾（2'-O-Me）且配對(duì)區(qū)毗鄰一個(gè)類(lèi)似K-turn的結(jié)構(gòu)（K-turn like），因此猜想bktRNA1可能指導(dǎo)2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶FBL催化U12的2'-O-甲基化修飾。為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，研究團(tuán)隊(duì)使用FBL蛋白的CLASH測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)bktRNA1與U12 snRNA形成長(zhǎng)的完全互補(bǔ)配對(duì)。并通過(guò)開(kāi)發(fā)基于熒光標(biāo)記的引物延伸技術(shù)（irPE）及利用CRISPR/Cas9敲除技術(shù)和回復(fù)實(shí)驗(yàn)等手段，證實(shí)了bktRNA1及其后向K-turn結(jié)構(gòu)基序?qū)τ诮閷?dǎo)U12 snRNA的第八位腺嘌呤核苷酸（Am8）的2'-O-甲基化修飾是必不可少的。
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過(guò)對(duì)四組刪除不同區(qū)域的bktRNA1-KO細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq測(cè)序及剪接分析，發(fā)現(xiàn)敲除bktRNA1影響超過(guò)75%的U12型內(nèi)含子剪接。進(jìn)一步通過(guò)qPCR和RT-PCR及回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了bktRNA1及U12上的2'-O-甲基化修飾決定了U12 型剪接的保真度。通過(guò)Northern Blot、ChIRP、RNA pull-down和RNA EMSA等實(shí)驗(yàn)手段對(duì)次要剪接體及U12 snRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)bktRNA1的缺失導(dǎo)致ZCRB1不能結(jié)合到次要剪接體。同時(shí)，對(duì)敲低ZCRB1的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序和細(xì)胞表型分析發(fā)現(xiàn)bktRNA1與ZCRB1對(duì)U12內(nèi)含子剪接及細(xì)胞表型影響都是一致的。這些結(jié)果表明由bktRNA1介導(dǎo)的U12 上2'-O-甲基化修飾對(duì)于將ZCRB1募集到 U11–U12 di-snRNP復(fù)合體以及U12型內(nèi)含子的剪接是必須的。
為了研究其他bktRNA在RNA剪接加工的作用，研究團(tuán)隊(duì)基于GFP內(nèi)含子報(bào)告載體研究了多個(gè)突變后向K-turn結(jié)構(gòu)基序的bktRNA，發(fā)現(xiàn)基序突變會(huì)影響超過(guò)80%隨機(jī)選擇的bktRNA所在內(nèi)含子的剪接加工（local intron splicing，局部?jī)?nèi)含子剪接）。進(jìn)一步通過(guò)利用Prime Editing技術(shù)也證實(shí)在體內(nèi)突變后向K-turn結(jié)構(gòu)基序會(huì)影響與15.5K蛋白的結(jié)合和局部?jī)?nèi)含子剪接。這些結(jié)果表明bktRNA是依賴(lài)于后向K-turn結(jié)構(gòu)基序調(diào)控局部?jī)?nèi)含子剪接。
綜上所述，這項(xiàng)研究工作通過(guò)開(kāi)發(fā)多種新實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算機(jī)算法發(fā)現(xiàn)了在固定位置具有后向K-turn結(jié)構(gòu)和序列基序的新類(lèi)型bktRNA，揭示了由bktRNA、RNA甲基化和RNA剪接體的相互作用（crosstalk）形成的新層次基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制（圖3）。這項(xiàng)工作將為發(fā)現(xiàn)其他bktRNA/ncRNA及剖析它們?cè)诩?xì)胞和疾病中的功能機(jī)制研究打開(kāi)了大門(mén)和提供全新的解決方案。
圖3 bktRNA的系統(tǒng)鑒定及功能機(jī)制研究
近日，該研究以“RIP-PEN-seq identifies a class of kink-turn RNAs as splicing regulators”為題在Nature Biotechnology上發(fā)表。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院為第一作者單位。本工作受到科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助。
