中大新聞網(wǎng)訊（通訊員駱觀(guān)正）目前生物界中已經(jīng)有超過(guò)150多種的RNA修飾堿基被報(bào)道，其中N6-甲基腺嘌呤（m6A）在脊椎動(dòng)物中含量最為豐富，也是被研究得最為透徹的一種修飾堿基。目前檢測(cè)m6A主要是基于二代測(cè)序的方法，這些方法存在假陽(yáng)性、操作復(fù)雜以及僅限于位點(diǎn)檢測(cè)等問(wèn)題。于是納米孔測(cè)序技術(shù)（Oxford Nanopore Technologies，ONT）成為了一種理想的取代方法。ONT測(cè)序平臺(tái)根據(jù)監(jiān)測(cè)單個(gè)分子在合成聚合物膜嵌入的納米孔中穿過(guò)時(shí)引起的電流變化直接測(cè)序DNA或RNA，修飾堿基穿孔產(chǎn)生的電流可能與對(duì)應(yīng)的經(jīng)典堿基有所不同，因此可以根據(jù)檢測(cè)到的電流差異來(lái)檢測(cè)包括m6A在內(nèi)的修飾堿基。自那時(shí)起，已經(jīng)有十余種計(jì)算工具被開(kāi)發(fā)出來(lái)（圖1），用于從直接RNA測(cè)序（Direct RNA Sequencing，DRS）中鑒定m6A的位置以及確定其化學(xué)計(jì)量。
圖1 利用ONT DRS平臺(tái)實(shí)現(xiàn)m6A檢測(cè)的工具、流程以及分類(lèi)
盡管已開(kāi)發(fā)出許多高度復(fù)雜、先進(jìn)的計(jì)算工具來(lái)檢測(cè)和量化m6A，但目前仍缺乏對(duì)這些工具進(jìn)行徹底評(píng)估和比較的研究。為填補(bǔ)這一空白，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院駱觀(guān)正教授課題組展開(kāi)相關(guān)研究。
本研究利用多物種多重復(fù)（小鼠胚胎細(xì)胞和擬南芥各兩個(gè)重復(fù)）樣本為評(píng)估數(shù)據(jù)，以多種驗(yàn)證集對(duì)這些工具進(jìn)行了全面評(píng)估（圖2），包括使用兩個(gè)連續(xù)評(píng)估指標(biāo)（接受者操作特征（Receiver Operating Characteristic，ROC）和精確度-召回率（Precision Recall，PR）曲線(xiàn)）對(duì)它們的性能進(jìn)行了定量評(píng)估，比較了它們檢測(cè)出的top位點(diǎn)的精確度，以及它們?cè)谧顑?yōu)閾值下檢測(cè)出的位點(diǎn)的準(zhǔn)確度，召回率以及F1得分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)工具在精確度和召回率之間存在權(quán)衡
圖2 檢測(cè)m6A的ONT工具能力的性能評(píng)價(jià)
除此之外，本研究還評(píng)估了這些工具在檢測(cè)過(guò)程中的內(nèi)在偏差，并證明引入負(fù)對(duì)照樣本可以提高大多數(shù)工具的性能。此外，還發(fā)現(xiàn)檢測(cè)能力在不同的motif之間存在差異，這是因?yàn)樵谀承┬蛄猩希娏鞑町惒蝗菀妆粰z測(cè)到。對(duì)于可以對(duì)m6A進(jìn)行定量的工具，在它們的計(jì)量估計(jì)中觀(guān)察到了廣泛的差異，即使在某些motif中可以獲得可接受的結(jié)果。測(cè)序深度和修飾的化學(xué)計(jì)量也是另外兩個(gè)重要的影響因素（圖3）。
圖3 檢測(cè)m6A的ONT工具的進(jìn)一步分析
綜上所述，研究為目前用于基于ONT DRS數(shù)據(jù)檢測(cè)m6A的計(jì)算工具提供了深入的見(jiàn)解，并強(qiáng)調(diào)了進(jìn)一步改進(jìn)這些工具的潛力，這些可能會(huì)成為未來(lái)研究的基礎(chǔ)。以上研究成果以“Systematic comparison of tools used for m6A mapping from nanopore direct RNA sequencing”為題，于2023年4月5日在Nature Communications雜志發(fā)表。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生鐘振東和謝應(yīng)源為文章的共同第一作者，駱觀(guān)正教授和張璋副教授為通訊作者。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院為第一作者單位。本工作受到科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金及深圳灣學(xué)者項(xiàng)目的資助。
