中大新聞網(wǎng)訊（通訊員田國(guó)寶）抗生素的發(fā)現(xiàn)是20世紀(jì)醫(yī)學(xué)史上最輝煌的成就之一。然而，隨著抗生素大量和無(wú)序使用，抗生素耐藥問(wèn)題則已成為21世紀(jì)人類(lèi)不得不面對(duì)的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)?？股啬退巻?wèn)題不僅是困擾臨床的一大難題，“超級(jí)耐藥細(xì)菌”的不斷出現(xiàn)更是引起公眾的極大恐慌，成為全球普遍關(guān)注的公共生物安全問(wèn)題。從遺傳學(xué)角度，耐藥性的產(chǎn)生是細(xì)菌為應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，尤其是抗生素選擇壓力下進(jìn)化的產(chǎn)物。在進(jìn)化歷程中，抗生素耐藥基因的每個(gè)核苷酸位點(diǎn)都可能發(fā)生突變，有些突變使細(xì)菌對(duì)抗生素更敏感，有些會(huì)導(dǎo)致更耐藥。在抗生素選擇壓力下，更耐藥的突變類(lèi)型會(huì)更容易被篩選出來(lái)，并引起逐步擴(kuò)散和傳播。
2022年4月29日，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院陳小舒教授、楊建榮教授和田國(guó)寶教授合作研究團(tuán)隊(duì)在Molecular Biology and Evolution在線(xiàn)發(fā)表題為“Prediction of Antibiotic Resistance Evolution by Growth Measurement of All Proximal Mutants of Beta-Lactamase”的研究論文。該工作以臨床廣泛流行的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaCTX-M為研究模型，構(gòu)建了包含blaCTX-M所有單點(diǎn)突變基因型的大腸桿菌克隆文庫(kù)，結(jié)合高通量測(cè)序和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型實(shí)現(xiàn)了對(duì)耐藥基因進(jìn)化的溯源和前瞻性預(yù)測(cè)。
研究團(tuán)隊(duì)利用混雜引物、以Fusion PCR的方法在耐藥基因中引入突變，構(gòu)建包含所有單堿基突變的等位基因庫(kù)，同時(shí)每個(gè)基因型均帶有隨機(jī)的條形碼。為了確保突變基因型在每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)一致，作者建立了一套高效的整合系統(tǒng)，將突變基因型整合到大腸桿菌MG1655的attHK022位點(diǎn)，最終獲得了等位基因突變體庫(kù)，并通過(guò)三代測(cè)序技術(shù)獲得基因型與條形碼的對(duì)應(yīng)關(guān)系。結(jié)合藥物篩選和二代測(cè)序技術(shù)，測(cè)定每個(gè)基因型在不同藥物濃度下的相對(duì)生長(zhǎng)值（Relative growth），并繪制了相應(yīng)的適應(yīng)度景觀(guān)（Fitness landscape）。有意思的是，部分位點(diǎn)，如P167、L169、E166，發(fā)生突變將顯著提高大腸桿菌的相對(duì)生長(zhǎng)值和MIC值，而這些突變體的主要富集在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶CTX-M的活性中心（圖1）。
圖1. 抗生素耐藥基因進(jìn)化適應(yīng)度景觀(guān)的建立
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步以適應(yīng)度景觀(guān)為基礎(chǔ)，分別建立了前瞻性預(yù)測(cè)模型（PEARP）和回顧性溯源模型（PEARR）。PEARP模型可用于預(yù)測(cè)新的突變基因型是否耐藥，其AUC為0.928。模型預(yù)測(cè)為耐藥的基因型（包括單點(diǎn)、雙點(diǎn)、三點(diǎn)、四點(diǎn)突變基因型）顯著富集于臨床分離到的基因型。PEARR模型可用于回顧性預(yù)測(cè)耐藥基因的進(jìn)化軌跡，且其預(yù)測(cè)的進(jìn)化軌跡在SSWM（Strong-Selection-Weak-Mutation）模型下與獨(dú)立的藥敏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符（圖2）。
圖2：抗生素耐藥基因進(jìn)化的回顧性溯源和前瞻性預(yù)測(cè)模型
綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的高通量平臺(tái)可用于精準(zhǔn)預(yù)測(cè)抗生素耐藥基因的進(jìn)化軌跡、輔助抗菌藥物設(shè)計(jì)和指導(dǎo)藥物使用，為臨床抗生素耐藥性防控提供有力支撐。
中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院副研究員馮思源、博士研究生吳卓幸、梁婉菲為論文共同第一作者，陳小舒教授、楊建榮教授和田國(guó)寶教授為論文通訊作者。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/molbev/msac086
