角膜上皮是位于眼表最外層的非角質(zhì)化復(fù)層磷狀上皮，作為屈光系統(tǒng)的屏障結(jié)構(gòu)，對(duì)維持眼球內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮了重要作用，其完整性和透明性并決定了視覺(jué)質(zhì)量。目前研究表明，角膜和球結(jié)膜交界處的角膜緣區(qū)域存在著角膜緣干細(xì)胞（limbal stem cell，LSC），是角膜上皮更新和損傷修復(fù)的主要來(lái)源。位于角膜緣基底層的LSC不斷進(jìn)行自我更新和分化，并向中央角膜遷移來(lái)替代死亡或受損的角膜上皮細(xì)胞（corneal epithelial cell，CEC），從而維持角膜上皮的穩(wěn)態(tài)。在臨床上，LSC缺乏或病變會(huì)導(dǎo)致角膜混濁、新生血管侵入、上皮結(jié)膜化、角膜基質(zhì)排列紊亂等癥狀，是世界上主要致盲原因之一。因而，探究LSC命運(yùn)決定和穩(wěn)態(tài)維持的機(jī)理具有重要意義。
哺乳動(dòng)物成體干細(xì)胞的命運(yùn)決定、自我更新和分化主要由染色質(zhì)的表觀(guān)遺傳結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)支配。染色質(zhì)順式調(diào)控增強(qiáng)子元件，尤其是超級(jí)增強(qiáng)子，通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子并與啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞或組織特異基因的表達(dá)。近年來(lái)，核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路（core transcription regulatory circuitry，CRC）模型，即超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)控的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子反過(guò)來(lái)相互調(diào)控各自的超級(jí)增強(qiáng)子，被證明在決定組織特異性和疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。大量研究表明，干細(xì)胞特性、可塑性和穩(wěn)態(tài)由多個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用通過(guò)建立特定的染色質(zhì)表觀(guān)遺傳結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究表明，PAX6作為L(zhǎng)SC命運(yùn)決定的master regulator，對(duì)角膜上皮發(fā)育起到必不可少的作用。然而，LSC的表觀(guān)遺傳圖譜及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子尚待進(jìn)一步探究，LSC中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也未有報(bào)道。
2021年1月18日，來(lái)自我校中山眼科中心的歐陽(yáng)宏及劉奕志團(tuán)隊(duì)在Nature communications雜志以research article形式發(fā)表題為“Core transcription regulatory circuitry orchestrates corneal epithelial homeostasis”的研究論文。該工作首次描繪了人類(lèi)LSC的組蛋白修飾和染色質(zhì)可及性圖譜，構(gòu)建了基于超級(jí)增強(qiáng)子與轉(zhuǎn)錄因子互作的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。鑒定超級(jí)增強(qiáng)子基因RUNX1和SMAD3是LSC的命運(yùn)決定和穩(wěn)態(tài)維持必不可少的轉(zhuǎn)錄因子。發(fā)現(xiàn)RUNX1、PAX6和SMAD3（RPS）蛋白相互作用，并形成一個(gè)LSC特異的CRC。特別地，RUNX1促進(jìn)了LSC中超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子區(qū)域的H3K27ac修飾但不影響H3K4me1、H3K4me3和H3K27me3。該工作也揭示，破壞RPS的協(xié)同作用與多種常見(jiàn)角膜疾病相關(guān)。
在這項(xiàng)研究工作中，研究人員通過(guò)解析LSC的4種組蛋白修飾 (H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3, H3K27me3)和染色質(zhì)可及性圖譜，構(gòu)建了CRC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出RUNX1和SMAD3作為潛在的候選關(guān)鍵因子（圖1）。
圖1 LSC特異的CRC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
利用ChIP-Seq分析表明，超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)控的RPS反過(guò)來(lái)相互共調(diào)控各自的超級(jí)增強(qiáng)子，也共同調(diào)控了額外的超級(jí)增強(qiáng)子網(wǎng)絡(luò)，形成了一個(gè)LSC特異的CRC（圖1）。在LSC中分別敲低RUNX1和SMAD3誘導(dǎo)LSC特性基因包括PAX6的表達(dá)明顯下調(diào)，而角質(zhì)化皮膚上皮特異基因的表達(dá)顯著上調(diào)。RUNX1或SMAD3敲低后的LSC會(huì)進(jìn)一步分化為角質(zhì)化的皮膚樣上皮細(xì)胞（圖2）。該文證明CRC轉(zhuǎn)錄因子RUNX1和SMAD3對(duì)維持LSC的命運(yùn)、特性和可塑性發(fā)揮了必不可少的作用。
圖2 RUNX1或SMAD3敲降誘導(dǎo)LSC命運(yùn)轉(zhuǎn)變
進(jìn)一步的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，RUNX1、PAX6和磷酸化SMAD3蛋白相互作用，形成三元復(fù)合物。通過(guò)聯(lián)合分析RNA-Seq和ChIP-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)RPS在基因組上共定位，通過(guò)協(xié)同調(diào)控超級(jí)增強(qiáng)子和普通增強(qiáng)子活性來(lái)影響維持LSC功能和特性關(guān)鍵基因的表達(dá)（圖3）。
圖3 RPS復(fù)合物正向調(diào)控超級(jí)增強(qiáng)子活性
接下來(lái)，在LSC中比較對(duì)照組和RUNX1干擾組的組蛋白修飾，發(fā)現(xiàn)干擾RUNX1導(dǎo)致了下游關(guān)鍵基因的超級(jí)增強(qiáng)子或普通增強(qiáng)子的H3K27ac水平顯著降低，但對(duì)H3K4me1、H3K4me3和H3K27me3沒(méi)有影響。敲低RUNX1破壞了大量超級(jí)增強(qiáng)子的形成，導(dǎo)致超級(jí)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)變?yōu)槠胀ㄔ鰪?qiáng)子（圖4），但干擾SMAD3對(duì)這4種組蛋白修飾均無(wú)影響。
圖4 RUNX1敲降破壞LSC譜系特異增強(qiáng)子的H3K27ac修飾
最后，研究人員通過(guò)分析臨床上常見(jiàn)的幾種角膜疾病（炎癥、潰瘍、白斑、堿燒傷），發(fā)現(xiàn)在一些病變的角膜上皮區(qū)域，角膜上皮特性標(biāo)記基因PAX6和KRT12的表達(dá)被沉默，轉(zhuǎn)而皮膚上皮標(biāo)記基因KRT1和KRT10被激活。在這些角質(zhì)化病變區(qū)域也觀(guān)察到RUNX1的缺失，但pSMAD3仍然被保留。pSMAD3由于沒(méi)有互作蛋白R(shí)UNX1和PAX6的協(xié)助，它的單獨(dú)存在不能維持角膜上皮特性，證明了RPS協(xié)同作用異常與人類(lèi)角膜疾病發(fā)生密切相關(guān)（圖5）。
圖5 RPS與角膜上皮病理學(xué)改變
綜上，該研究首次描繪了人LSC的染色質(zhì)景觀(guān)，鑒定RUNX1和SMAD3作為L(zhǎng)SC的核心轉(zhuǎn)錄因子，與PAX6形成CRC通過(guò)協(xié)同調(diào)控超級(jí)增強(qiáng)子來(lái)維持角膜上皮的特性和穩(wěn)態(tài)。本研究揭示了決定成體干細(xì)胞命運(yùn)、特性和可塑性的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)（圖6）。
圖6 譜系特異轉(zhuǎn)錄因子建立的CRC模型決定角膜上皮特性
