單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）可通過(guò)轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)育、再生、衰老、以及疾病發(fā)生過(guò)程中的細(xì)胞和分子機(jī)制。然而，目前大多數(shù)的定量方法局限在基因水平，無(wú)法區(qū)分具有不同結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的差異表達(dá)。
最近，我校中山眼科中心劉奕志和胡友金團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種低成本、高效的新型單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)scRCAT-seq，并應(yīng)用于分析人視網(wǎng)膜發(fā)育的細(xì)胞圖譜，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化及細(xì)胞命運(yùn)決定過(guò)程中TSS和TES的變化規(guī)律。研究成果于2020年10月13日，在Nature Communications在線(xiàn)發(fā)表論文“Single-cell RNA cap and tail sequencing (scRCAT-seq) reveals subtype-specific isoforms differing in transcript demarcation”。
結(jié)合轉(zhuǎn)錄本首尾捕獲和機(jī)器學(xué)習(xí)系統(tǒng)分析TSS和TES
在此研究中，scRCAT-seq通過(guò)對(duì)單細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA的5’及3’進(jìn)行靶向捕獲，基于常規(guī)的短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（圖1），結(jié)合隨機(jī)森林（random forest, RF）等機(jī)器學(xué)習(xí)算法獲得高準(zhǔn)確性的TSS和TES（圖2）。與已報(bào)道的測(cè)序方法進(jìn)行比較，scRCAT-seq可顯著提高所鑒定TSSs/TESs的準(zhǔn)確性4-5倍。
圖1：scRCAT-seq的實(shí)驗(yàn)流程示意圖
圖2：機(jī)器學(xué)習(xí)算法顯著提高所鑒定TSSs/TESs的準(zhǔn)確性
ScRCAT-seq具有低成本、高效率的特點(diǎn)
與已有的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序方法Smart-seq2和ScISOr-seq相比，scRCAT-seq具有成本低，效率高等特點(diǎn)。以相同的成本，scRCAT-seq所能檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量是ScISOr-seq的7倍（圖3），scRCAT-seq能檢測(cè)到大量ScISOr-seq所不能檢測(cè)到的低表達(dá)的基因。
圖3：scRCAT-seq具有高效率、低成本的特點(diǎn)
scRCAT-seq的可適性強(qiáng)
scRCAT-seq適用于分析不同物種來(lái)源、不同細(xì)胞類(lèi)型和數(shù)量的樣品，進(jìn)行細(xì)胞分群，細(xì)胞類(lèi)型特異的轉(zhuǎn)錄本鑒定，穩(wěn)定性好，并可在不同物種和細(xì)胞中標(biāo)注新的轉(zhuǎn)錄本，豐富現(xiàn)有標(biāo)注RNA轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)庫(kù)。scRCAT-seq可與單細(xì)胞三代測(cè)序技術(shù)，或者sanger測(cè)序技術(shù)結(jié)合，對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，特別是內(nèi)在外顯子進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。
應(yīng)用于分析人視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組TSS和TES的動(dòng)態(tài)變化
以人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜類(lèi)器官為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)10571個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析，該研究描繪了視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（RPC）向光感受器前體細(xì)胞（PR precursors），進(jìn)一步向視錐細(xì)胞（cone）分化的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體變化最顯著的時(shí)間點(diǎn)發(fā)生在RPC向光感受器前體細(xì)胞轉(zhuǎn)變的節(jié)點(diǎn)。該研究還發(fā)現(xiàn)CCND1異構(gòu)體可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，介導(dǎo)RPC向光感受器前體細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)換（圖4）。
圖4：人類(lèi)視錐細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中RNA異構(gòu)體的動(dòng)態(tài)變化
