中大新聞網(wǎng)訊（通訊員楊建華）信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)上有超過(guò)170種不同類(lèi)型的化學(xué)修飾—統(tǒng)稱(chēng)為表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組（Epitranscriptome）。絕大多數(shù)修飾（如：m6A、m5C）都是發(fā)生在RNA的堿基上，而2'-O-甲基化修飾(2'-O-Methylation, Nm)是發(fā)生在RNA的核糖上最豐富的修飾，并廣泛存在于各種生物的各類(lèi)RNA中。它參與調(diào)控RNA的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)形成、生物生成及mRNA的剪接和翻譯等，并與各種疾病密切相關(guān)。重要的是，2'-O-甲基化修飾是真核生物用于區(qū)分自己和非己mRNA的分子信號(hào)，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。然而，由于目前檢測(cè)2'-O-甲基化修飾方法的局限性，它在低豐度的ncRNA和mRNA的精確分布圖譜、動(dòng)態(tài)變化、功能和機(jī)制仍有待闡明。

近日，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊建華/屈良鵠教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了在全轉(zhuǎn)錄組單堿基分辨率檢測(cè)2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)的Nm-REP-seq新技術(shù)，并在人、小鼠和果蠅等組織和細(xì)胞中系統(tǒng)鑒定mRNA和ncRNA內(nèi)部及末端的2’-O-甲基化修飾位點(diǎn)。團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于核酸外切酶MgR（Mycoplasma genitalium RNase R）富集2'-O-甲基化修飾RNA和2'-O-甲基化修飾耐受NaIO4氧化的新方法Nm-REP-seq（圖1）。該方法使用的RNA 3'-5'核酸外切酶MgR消化RNA時(shí)會(huì)停止在含有2'-O-甲基化修飾的核苷酸下游的一位核苷酸位置?；贛gR的這一重要特性，Nm-REP-seq可以顯著的富集2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)。進(jìn)一步結(jié)合2輪氧化—消除核苷酸—去磷酸化（oxidation-elimination-dephosphorylation，OED）步驟，可以消除MgR處理后的2'-O-甲基化修飾的下游核苷酸，精確地定位2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)。結(jié)合以上提及的酶學(xué)和化學(xué)兩種不同的正交方法和新的計(jì)算機(jī)分析方法，Nm-REP-seq具有非常高的特異性去鑒定各類(lèi)RNA的2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)。

圖1：開(kāi)發(fā)Nm-REP-seq新技術(shù)在全轉(zhuǎn)錄組單堿基分辨率檢測(cè)2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)

應(yīng)用Nm-REP-seq技術(shù)于人、小鼠和果蠅等的組織或細(xì)胞RNA，Nm-REP-seq鑒定已知的2'-O-甲基化修飾位點(diǎn)的精確度高達(dá)98%和靈敏度達(dá)到82%以上。重要的是，Nm-REP-seq除了在mRNA鑒定大批新的修飾位點(diǎn)，還首次發(fā)現(xiàn)snoRNA、scaRNA、端粒酶RNA（TERC RNA）等RNA分子上存在2'-O-甲基化修飾。進(jìn)一步提升Nm-REP-seq的文庫(kù)構(gòu)建策略，Nm-REP-seq還可以用于鑒定各類(lèi)RNA的3'末端的2'-O-甲基化修飾，并首次發(fā)現(xiàn)snoRNA、snRNA和tRNA末端及其加工產(chǎn)生的功能小RNA分子（如：tRF，snoRF，snRF）的末端存在2'-O-甲基化修飾。有趣的是，Nm-REP-seq不僅發(fā)現(xiàn)某些2'-O-甲基化修飾受到snoRNA的指導(dǎo)，還發(fā)現(xiàn)可能存在一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶特異識(shí)別tRNA的T-Loop上固定位置的2'-O-甲基化修飾的生成。此外，該研究為了分析Nm-REP-seq產(chǎn)生的大規(guī)模測(cè)序數(shù)據(jù)，還開(kāi)發(fā)了基于4個(gè)重要罰分特征的endSeeker計(jì)算機(jī)軟件和用于可視化RNA修飾的基因組區(qū)域?yàn)g覽器trackBrowser（圖2）。

圖2：開(kāi)發(fā)trackBrowser軟件展示Nm-REP-seq鑒定的2’-O-甲基化修飾位點(diǎn)

Nm-REP-seq聯(lián)合酶學(xué)和化學(xué)方法克服了化學(xué)法或引物延伸法的多個(gè)局限性，優(yōu)越性體現(xiàn)如下：不依賴(lài)于RNA片段的大??；文庫(kù)起始RNA需求量少；避免RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)和其它RNA修飾影響；特異性和靈敏度高。將來(lái)進(jìn)一步的提升Nm-REP-seq的建庫(kù)策略也將能用于鑒定mRNA帽子端2'-O-甲基化修飾。綜上，該研究不僅鑒定2'-O-甲基化修飾在各類(lèi)RNA的精確分布圖譜，也為進(jìn)一步闡明2'-O-甲基化修飾的生成機(jī)制及其在生理和病理過(guò)程中的作用提供了新方法。

該研究以“Single-base Resolution Mapping of 2'-O-Methylation Sites by an Exoribonuclease-Enriched Chemical Method”為題發(fā)表在Science China Life Sciences。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊建華教授、屈良鵠教授和特聘副研究員李斌為該項(xiàng)工作的共同通訊作者，博士研究生張萍和黃鈞鴻為本文共同第一作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目資助。

論文鏈接：https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-022-2210-0

開(kāi)發(fā)的endSeeker軟件(C/C++編程語(yǔ)言)：https://github.com/sysu-software/endSeeker

開(kāi)發(fā)的trackBrowser軟件（Perl編程語(yǔ)言）：https://github.com/junhong-huang/trackBrowser