中大新聞網(wǎng)訊（通訊員張璋）RNA被認(rèn)為是生命出現(xiàn)伊始就存在的生物大分子。漫長(zhǎng)的演化歷程中，RNA逐漸從生命信息存儲(chǔ)和表達(dá)的雙重身份中特化出來(lái)，成為傳遞信息的媒介。處在中心法則中間的RNA，即不像DNA存儲(chǔ)遺傳信息，也不像蛋白質(zhì)直接體現(xiàn)生命活動(dòng)，只有以少數(shù)特例存在的形式下，如病毒、核酶，還提醒人們它仍然保留來(lái)自遠(yuǎn)古的使命。近年來(lái)，表觀(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)（epitranscriptomics）學(xué)說(shuō)的提出為該領(lǐng)域注入了新的思想。人們發(fā)現(xiàn)，真核生物不同種類(lèi)RNA上存在超過(guò)150種不同的化學(xué)修飾，其中很大部分繼承于古老的共同祖先。這些修飾或參與了RNA與其它大分子的互作，或影響了RNA本身的代謝，在生命過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。
準(zhǔn)確且定量地鑒定RNA修飾位點(diǎn)及其修飾比例，是深入了解RNA修飾的分布、功能及其背后的機(jī)理機(jī)制的前提。然而如何得到高置信度、單堿基精度RNA修飾位點(diǎn)，以及對(duì)修飾位點(diǎn)的精準(zhǔn)定量是目前領(lǐng)域內(nèi)的研究難點(diǎn)。近年來(lái)，多種新技術(shù)的出現(xiàn)使得檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組中的各種RNA修飾位點(diǎn)成為可能。盡管領(lǐng)域內(nèi)已有多種RNA修飾檢測(cè)方法可供選擇，但是在實(shí)際應(yīng)用中效果往往差強(qiáng)人意。高假陽(yáng)性率、低分辨率的問(wèn)題時(shí)常困擾研究者。某些情況下，不同研究報(bào)道的同一種修飾的位點(diǎn)數(shù)甚至能相差2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。即使是目前相對(duì)成熟、應(yīng)用最廣的MeRIP-seq技術(shù)，也存在大量非特異性抗體富集和低重復(fù)性問(wèn)題。
為了解決RNA修飾檢測(cè)中所面臨的方法學(xué)難題，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院駱觀(guān)正教授團(tuán)隊(duì)提出了一種新的方法。通過(guò)構(gòu)建全轉(zhuǎn)錄組無(wú)修飾RNA文庫(kù)作為負(fù)對(duì)照，全面評(píng)估了現(xiàn)有基于二代測(cè)序的RNA修飾檢測(cè)技術(shù)，并為修飾位點(diǎn)的精確鑒定提供系統(tǒng)的解決方案。該研究成果發(fā)表在Nature Methods雜志上，題為"Systematic calibration of the epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library "。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院為第一署名單位，副研究員張璋和博士后陳濤為共同第一作者，駱觀(guān)正教授為通訊作者。文中所涉及到的方法已申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)利。
面對(duì)噪音較大的生物數(shù)據(jù)，引入對(duì)照來(lái)鑒別假陽(yáng)性是經(jīng)典的思路。在前人的研究中，為了提高現(xiàn)有修飾檢測(cè)方法的可信度，有時(shí)會(huì)利用負(fù)對(duì)照樣本對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正。比如有研究使用敲除甲基轉(zhuǎn)移酶(“writer”)的樣品作為對(duì)照?；蛘呃萌ゼ谆t酶（eraser）在體外反應(yīng)獲得去除修飾的樣本，亦或是使用合成的無(wú)修飾的RNA oligo。然而這些負(fù)對(duì)照樣本身存在較大的不足，比如體外反應(yīng)很難完全去掉修飾位點(diǎn)，合成的RNA oligo只能代表部分序列等。因此，最好的負(fù)對(duì)照樣本應(yīng)該具有與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄組同樣的序列和基因表達(dá)水平，但是并不含有修飾堿基的一套完整的人工轉(zhuǎn)錄組。本研究采用體外合成全轉(zhuǎn)錄組RNA (IVT RNA) 文庫(kù)的方法構(gòu)建了無(wú)修飾的RNA文庫(kù)（圖1），隨后將其作為負(fù)對(duì)照用來(lái)校正現(xiàn)有的修飾檢測(cè)方法。文中以?xún)煞N最受關(guān)注的RNA修飾m6A和m5C作為代表，分別驗(yàn)證了該方法在三種典型研究場(chǎng)景中的有效性（圖2）。
圖1 體外合成RNA文庫(kù)（IVT RNA）具有與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄組相似的表達(dá)量，但不含有修飾堿基。
圖2 使用IVT RNA校準(zhǔn)RNA修飾檢測(cè)的三個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景。
MeRIP-seq（或m6A-seq）是目前最常用的RNA修飾檢測(cè)方法，被大范圍的用在m6A相關(guān)研究中。該方法原理是用m6A特異性的抗體對(duì)片段化的RNA進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，將含有m6A的片段富集出來(lái)進(jìn)行測(cè)序。在研究同時(shí)對(duì)體外轉(zhuǎn)錄IVT RNA文庫(kù)也進(jìn)行MeRIP-seq，結(jié)果表明即使是對(duì)不含m6A修飾的IVT RNA文庫(kù)，抗體依舊能夠富集到大量RNA片段，并且這些富集的“peak”在已發(fā)表結(jié)果數(shù)據(jù)中重復(fù)出現(xiàn)，表明MeRIP-seq其實(shí)受到假陽(yáng)性信號(hào)的嚴(yán)重干擾。分析IVT RNA中被富集下來(lái)的區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域所在的基因表達(dá)量較高且富含腺嘌呤。去除假陽(yáng)性信號(hào)后，鑒定出來(lái)的修飾區(qū)域更準(zhǔn)確（圖3）。
圖3 使用IVT RNA文庫(kù)對(duì)MeRIP-seq進(jìn)行校正。
m6A-REF-seq是一種借助m6A敏感內(nèi)切核酸酶MazF來(lái)實(shí)現(xiàn)的m6A單堿基檢測(cè)方法。該方法由駱觀(guān)正課題組和以色列魏茨曼科學(xué)研究學(xué)院Schraga Schwartz組在2019年分別獨(dú)立發(fā)表（詳見(jiàn)Cell+Sci Adv共同關(guān)注丨抗體非依賴(lài)m6A精準(zhǔn)鑒定方法，助力解決領(lǐng)域內(nèi)重大爭(zhēng)議https://mp.weixin.qq.com/s/nokmeX7gt5VoiuKK4iepKw）。在本研究中，作者將IVT RNA樣本作為負(fù)對(duì)照進(jìn)行m6A-REF-seq校正，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在大量假陽(yáng)性位點(diǎn)。高精準(zhǔn)度的m6A單堿基圖譜也為領(lǐng)域提供了新的知識(shí)，如擴(kuò)展motif序列，定量分布規(guī)律等，為進(jìn)一步深入分析m6A的機(jī)制和功能創(chuàng)造了前提。通過(guò)對(duì)假陽(yáng)性位點(diǎn)的深入分析，發(fā)現(xiàn)某些特定序列和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)干擾MazF酶切反應(yīng)，是產(chǎn)生假陽(yáng)性的主要原因（圖4）。
圖4 使用IVT RNA文庫(kù)對(duì)m6A-REF-seq進(jìn)行校正。
最后該研究把IVT RNA應(yīng)用到另一種常見(jiàn)RNA修飾m5C的檢測(cè)中。BS-seq使用重亞硫酸鹽對(duì)不含修飾的C進(jìn)行處理，使其在PCR之后轉(zhuǎn)換為T(mén)，而m5C修飾并不能進(jìn)行該轉(zhuǎn)換。在研究中如果處理不完全，會(huì)引入大量的假陽(yáng)性位點(diǎn)。該研究在BS-seq中加入IVT RNA作為負(fù)對(duì)照，得到高置信度的m5C位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)即使重亞硫酸鹽處理得不是非常嚴(yán)格，引入IVT RNA依然能夠起到明顯的校正效果，降低了檢測(cè)結(jié)果中的假陽(yáng)性率。
綜上，該研究提出了一種體外合成全轉(zhuǎn)錄組無(wú)修飾RNA的技術(shù)，并應(yīng)用于三類(lèi)主要的RNA修飾檢測(cè)方法中，系統(tǒng)性地對(duì)常用的RNA修飾檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估和校正，提高了修飾位點(diǎn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，獲得了高置信度位點(diǎn)信息和定量圖譜。相對(duì)于使用體內(nèi)敲除甲基轉(zhuǎn)移酶樣本作為負(fù)對(duì)照，該方法可以保證合成的RNA庫(kù)完全無(wú)修飾，且可以通過(guò)簡(jiǎn)單的方式快速獲得，不受物種和樣本本身的限制，有望成為目前和未來(lái)RNA修飾檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。
