中大新聞網(wǎng)訊（通訊員李劍峰）CRISPR衍生的胞嘧啶/腺嘌呤堿基編輯器（CBE/ABE）由Cas9缺刻酶（nCas9）與胞苷或腺苷脫氨酶融合而成，能夠高效實(shí)現(xiàn)基因組C>T或A>G的堿基突變，對(duì)動(dòng)植物基因功能研究、作物分子育種和人類(lèi)遺傳病治療具有重要意義，被喻為CRISPR皇冠上的明珠。和CRISPR技術(shù)一樣，CBE/ABE也會(huì)因gRNA結(jié)合到基因組中與靶序列相似的序列而造成脫靶編輯（即gRNA依賴(lài)性脫靶）。近年來(lái)的研究進(jìn)一步表明，CBE/ABE包含的胞苷或腺苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域會(huì)在動(dòng)植物基因組和轉(zhuǎn)錄組中造成不可預(yù)測(cè)的DNA/RNA隨機(jī)脫靶編輯（即gRNA非依賴(lài)性脫靶）。這種隨機(jī)脫靶給CBE/ABE的廣泛應(yīng)用帶來(lái)了負(fù)面影響。目前，解決gRNA非依賴(lài)性脫靶主要依賴(lài)點(diǎn)突變提高脫氨酶的高保真性或引入額外的脫氨酶活性調(diào)控元件。然而，提高脫氨酶特異性的點(diǎn)突變策略缺乏通用性，無(wú)法適用于不同序列/類(lèi)型的脫氨酶，而且消除DNA和RNA脫靶的點(diǎn)突變疊加后可能會(huì)同時(shí)降低脫氨酶在靶位點(diǎn)的脫氨效率；引入脫氨酶調(diào)控元件則會(huì)增加系統(tǒng)的復(fù)雜性，也可能降低其通用性。
近日，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李劍峰課題組在Nature Plants發(fā)表了題為“Split complementation of base editors to minimize off-target edits”的研究論文，報(bào)道了一種簡(jiǎn)單普適的CBE/ABE脫靶消除策略，即SAFE（split deaminase for safe editing）策略。該策略能夠在水稻、擬南芥植株以及人、酵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效、低脫靶的堿基編輯。Nature Plants同期以研究簡(jiǎn)報(bào)的形式對(duì)該研究進(jìn)行了推薦。
作者首先提出關(guān)于SAFE策略的構(gòu)想：從插入nCas9內(nèi)部的脫氨酶結(jié)構(gòu)域?qū)A基編輯器拆分為N端和C端兩部分，使脫氨酶和nCas9同時(shí)失活，以防止脫氨酶的組成型活性造成gRNA非依賴(lài)性脫靶。在靶位點(diǎn)處，利用gRNA作為分子膠將拆分的兩部分穩(wěn)定重構(gòu)為具備完全活性的堿基編輯器，從而實(shí)現(xiàn)中靶編輯。作者隨后基于脫氨酶嵌入型CBE和ABE（即PIGS-AID10和PIGS-ABE8e），在胞苷脫氨酶AID10或腺苷脫氨酶TadA8e的無(wú)序區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)了7個(gè)候選拆分位點(diǎn)，利用植物原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和CBE/ABE的編輯活性報(bào)告系統(tǒng)對(duì)PIGS-AID10或PIGS-ABE8e的7種N端片段與7種C端片段之間形成的28種有效組合進(jìn)行了重組編輯活性篩選。發(fā)現(xiàn)從AID10的Gly156-Arg157之間拆分PIGS-AID10或從TadA8e的Gly125-Met126之間拆分PIGS-ABE8e，可實(shí)現(xiàn)gRNA介導(dǎo)的中靶編輯。進(jìn)一步，在水稻、擬南芥植株以及人HEK293T細(xì)胞、酵母中先后驗(yàn)證了前述策略介導(dǎo)的中靶編輯效率并全面評(píng)估了脫靶效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該策略確實(shí)能夠大幅抑制gRNA非依賴(lài)的基因組和轉(zhuǎn)錄組隨機(jī)脫靶編輯。意外的是，該策略同時(shí)還能夠降低gRNA依賴(lài)的DNA脫靶編輯，并且能夠完全抑制CBE造成的缺失或插入（indel）突變?？傊琒AFE策略不僅全面提升了動(dòng)植物中堿基編輯的安全性和產(chǎn)物純度，而且對(duì)不同脫氨酶變體組成的堿基編輯器通用，同時(shí)無(wú)需引入額外的脫氨酶活性調(diào)控元件?？深A(yù)見(jiàn)的是，拆分后的堿基編輯器由于分子量變小，更利于病毒載體介導(dǎo)的堿基編輯器遞送和在作物與人細(xì)胞中的表達(dá)。
研究示意圖
中山大學(xué)已畢業(yè)博士生熊翔宇和博士后劉科輝為該論文的共同第一作者，李劍峰教授和博士后劉科輝為共同通訊作者。中山大學(xué)賀雄雷教授、博士后黎鎮(zhèn)祥、夏凡女和博士生阮雪銘參與了該研究。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)專(zhuān)項(xiàng)等經(jīng)費(fèi)資助。
