中大新聞網(wǎng)訊（通訊員李劍峰）真核生物基因組中廣泛存在大量在染色體上串聯(lián)排列的同源基因，稱(chēng)為tandemly arrayed genes或TAG。TAG在擬南芥、水稻、小麥、楊樹(shù)、玉米基因組中占比約14~35%，在人和小鼠中占比約14~17%。TAG的功能研究需要同時(shí)解決基因功能冗余和染色體連鎖兩大難題，而CRISPR技術(shù)為T(mén)AG的功能研究提供了完美的工具。理論上，僅需使用一對(duì)gRNA分別靶向TAG的頭和尾兩個(gè)基因，則可將整段攜帶TAG的染色體刪除，從而實(shí)現(xiàn)TAG的功能缺失。但值得注意的是，近年來(lái)在動(dòng)植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CRISPR技術(shù)在染色體上產(chǎn)生的多個(gè)DNA雙鏈斷裂（DSB）會(huì)誘發(fā)染色體的異常變異，如重排、倒置等等。
近日，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李劍峰課題組在Nature Communications發(fā)表了題為“Hidden prevalence of deletion-inversion bi-alleles in CRISPR-mediated deletions of tandemly arrayed genes in plants”的研究論文，報(bào)道了在成對(duì)的gRNA引導(dǎo)下，CRISPR介導(dǎo)的TAG敲除會(huì)引發(fā)高頻的染色體缺失/倒置雙等位變異。該雙等位突變體極易被傳統(tǒng)基于三引物法的基因型鑒定PCR誤判為純合缺失突變體，繼而會(huì)給后續(xù)的TAG功能研究埋下隱患。
作者首先為了研究擬南芥基因組中編碼PEP細(xì)胞因子前體（PROPEP）的典型TAG功能，設(shè)計(jì)了成對(duì)的gRNA對(duì)串聯(lián)的多個(gè)PROPEP基因進(jìn)行CRISPR/Cas9敲除，并通過(guò)傳統(tǒng)三引物法鑒定純合缺失突變體。所謂三引物法是指先用分別結(jié)合于TAG兩側(cè)的一對(duì)相向引物進(jìn)行第一次（tier-1）PCR，出現(xiàn)陽(yáng)性的小分子量PCR條帶則說(shuō)明存在染色體刪除；再用分別結(jié)合于TAG外側(cè)及內(nèi)部的一對(duì)相向引物進(jìn)行第二次（tier-2）PCR，無(wú)PCR條帶則說(shuō)明缺失正常的TAG序列；兩次PCR的結(jié)果可共同鑒定出純合缺失突變體。然而，在對(duì)獲得的“純合缺失”突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)，作者意外發(fā)現(xiàn)位于TAG內(nèi)部“已被刪除”的PROPEP基因仍在表達(dá)。結(jié)合前述PCR結(jié)果與隨后進(jìn)行的TAIL-PCR和Sanger測(cè)序，最終發(fā)現(xiàn)一條染色體上的TAG已被刪除，而另一條同源染色體上的TAG則在兩個(gè)DSB位點(diǎn)之間發(fā)生了倒置，因而tier-2 PCR未能產(chǎn)生PCR條帶，引起對(duì)基因型的誤判。該突變體的子代中，缺失、倒置兩種基因型的分離進(jìn)一步確認(rèn)了親代的缺失/倒置雙等位突變形式。基于deletion和inversion兩個(gè)已有術(shù)語(yǔ)，該研究將此種新的雙等位突變形式命名為delinver突變。
圖1. 模式植物擬南芥中串聯(lián)同源基因的CRISPR敲除誘發(fā)意外的敲除/倒置雙等位突變體。a, 擬南芥的PROPEP基因家族是代表性的串聯(lián)同源基因。b, CRISPR敲除PROPEP1-8所用的成對(duì)gRNA靶向示意圖。c, PROPEP1在傳統(tǒng)三引物法PCR鑒定的“敲除”突變體propep1-8 #2-4植株中仍存在表達(dá)。d, PROPEP1應(yīng)答的抗病基因在“敲除”突變體propep1-8 #2-4中仍有正常應(yīng)答。e,f, 新的PCR鑒定策略揭示propep1-8 #2-4突變體是敲除/倒置雙等位突變體。
接下來(lái)，通過(guò)對(duì)擬南芥、水稻中多個(gè)不同的TAG進(jìn)行成對(duì)gRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9敲除，在近2650個(gè)轉(zhuǎn)基因植株或愈傷組織中，共有31對(duì)gRNA成功產(chǎn)生大片段的TAG敲除，其中有27對(duì)gRNA能夠造成delinver突變。比如，在對(duì)編碼擬南芥NLR免疫受體AT5G45240/AtRPS4/AtRRS1進(jìn)行的12組TAG敲除中，某些成對(duì)gRNA所誘導(dǎo)的TAG敲除突變體中有高達(dá)~80%實(shí)際上是delinver突變體，12組的中位數(shù)為~51%。Delinver突變的發(fā)生與TAG所在的染色體位置、刪除片段的大小均無(wú)顯著相關(guān)性，但總體上與該對(duì)gRNA所造成的TAG刪除效率呈正相關(guān)性。此外，切割產(chǎn)生粘末端的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)與切割產(chǎn)生平末端的CRISPR/Cas9系統(tǒng)一樣，在植物原生質(zhì)體細(xì)胞中也會(huì)誘導(dǎo)delinver突變。進(jìn)一步，作者發(fā)現(xiàn)成對(duì)gRNA介導(dǎo)的CRISPR敲除在植物基因組的非TAG位點(diǎn)（比如，TAG的相鄰區(qū)域或者代謝基因簇）也會(huì)產(chǎn)生頻率相似的delinver突變。這些結(jié)果表明，成對(duì)gRNA介導(dǎo)的CRISPR敲除在植物基因組上誘導(dǎo)delinver突變是一種普遍現(xiàn)象。為了防止delinver突變體被誤判為純合缺失突變體進(jìn)而誤導(dǎo)TAG的功能研究，作者建議在TAG敲除突變體的基因型PCR篩選時(shí)通過(guò)一對(duì)同向引物進(jìn)行第三次（tier-3）PCR，其陰性或陽(yáng)性PCR產(chǎn)物則可分別反映出該突變體是純合缺失突變體還是delinver突變體。
圖2. 新的PCR鑒定策略能夠區(qū)分串聯(lián)同源基因的純合敲除突變體與敲除/倒置雙等位突變體。左圖為串聯(lián)同源基因（TAG）的CRISPR敲除策略示意圖，圖中展示了成對(duì)gRNA的靶點(diǎn)以及基因型鑒定所用PCR引物的靶點(diǎn)。右圖為基因型鑒定PCR的結(jié)果與基因型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。四種基因型從左至右依次是野生型、雜合TAG敲除、純化TAG敲除、TAG敲除/倒置雙等位。加號(hào)和減號(hào)分別代表使用對(duì)應(yīng)PCR引物獲得或未獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
中山大學(xué)博士生劉玖爾和副研究員王鳳珠為該論文的共同第一作者，李劍峰教授為通訊作者。博士生李沖、博士后李雨佳參與了該研究。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)專(zhuān)項(xiàng)等經(jīng)費(fèi)資助。
