中大新聞網(wǎng)訊（通訊員李佳璇）擴(kuò)增子捕獲 (Amplicon capture) 是一種經(jīng)濟(jì)高效的分子系統(tǒng)學(xué)數(shù)據(jù)收集方法。該方法首先利用通用擴(kuò)增引物集從目標(biāo)生物類(lèi)群的代表物種中擴(kuò)增大量的目標(biāo)PCR片段 (即擴(kuò)增子)；然后在這些片段的兩端添加生物素化的接頭，并用生物素標(biāo)記的接頭引物對(duì)片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量含有生物素標(biāo)記的擴(kuò)增子探針；接著就可以利用這些探針從DNA文庫(kù)中“釣”取特定區(qū)域并進(jìn)行高通量測(cè)序 (圖1)。在擴(kuò)增子捕獲實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增子探針的數(shù)量和組成可以根據(jù)項(xiàng)目需求靈活調(diào)整，制備周期短，實(shí)驗(yàn)成本低，捕獲得到的數(shù)據(jù)完整，因此該方法廣泛適用于從種級(jí)至綱級(jí)的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究。

圖1. 擴(kuò)增子捕獲用于系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究的一般工作流程

開(kāi)展擴(kuò)增子捕獲實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在于擁用大量類(lèi)群通用的擴(kuò)增引物集，但目前這些通用的擴(kuò)增引物資源卻相當(dāng)有限，僅在脊椎動(dòng)物、甲蟲(chóng)和鱗翅目昆蟲(chóng)中有少量的積累，這極大限制了擴(kuò)增子捕獲的廣泛應(yīng)用。目前國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)中動(dòng)物的基因組數(shù)據(jù)正在快速積累，覆蓋了大多數(shù)后生動(dòng)物類(lèi)群，這為通用擴(kuò)增引物的開(kāi)發(fā)提供了重要的數(shù)據(jù)來(lái)源。然而，大規(guī)模分析大量物種的基因組數(shù)據(jù)并進(jìn)行引物開(kāi)發(fā)需要豐富的基因組數(shù)據(jù)分析經(jīng)驗(yàn)和引物設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)絕大多數(shù)研究者而言是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。針對(duì)這一問(wèn)題，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張鵬團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一款名為UPrimer的通用擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)程序。它能夠以基因組數(shù)據(jù)為輸入，全自動(dòng)化的為給定生物類(lèi)群大規(guī)模開(kāi)發(fā)通用擴(kuò)增引物集，助力擴(kuò)增子捕獲實(shí)驗(yàn)在相關(guān)生物類(lèi)群中開(kāi)展。

UPrimer采用Python語(yǔ)言編寫(xiě)，包含兩大模塊，涵蓋了通用擴(kuò)增引物開(kāi)發(fā)的全部過(guò)程。與其他的通用引物設(shè)計(jì)程序相比，UPrimer有兩個(gè)獨(dú)創(chuàng)之處：一是具備全自動(dòng)化的引物開(kāi)發(fā)模式。研究者僅需要輸入一行簡(jiǎn)單的命令，UPrimer就能自行分析基因組數(shù)據(jù)并輸出目標(biāo)生物類(lèi)群的通用擴(kuò)增引物表。該表可直接用于引物合成以及后續(xù)的擴(kuò)增子捕獲實(shí)驗(yàn)。二是引物設(shè)計(jì)采用巢式PCR引物設(shè)計(jì)策略，即設(shè)計(jì)兩對(duì)引物擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域。該策略能夠大大增加基因片段的擴(kuò)增成功率 (>90%)，顯著提升擴(kuò)增子探針制備的效率。

借助UPrimer，研究人員為21個(gè)后生動(dòng)物類(lèi)群開(kāi)發(fā)了擴(kuò)增通用引物集，覆蓋了節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、扁形動(dòng)物、棘皮動(dòng)物以及脊椎動(dòng)物等主要多細(xì)胞動(dòng)物分類(lèi)單元，每套引物集包含約1,000個(gè)基因片段。為了驗(yàn)證UPrimer開(kāi)發(fā)引物的擴(kuò)增性能，研究團(tuán)隊(duì)選取了六個(gè)后生動(dòng)物代表類(lèi)群進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)試。結(jié)果表明，無(wú)論在亞目、目、綱還是亞門(mén)級(jí)的分類(lèi)水平，UPrimer設(shè)計(jì)的通用引物集均能高特異性的擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段，擴(kuò)增成功率均超過(guò)90% (圖2)，這表明UPrimer開(kāi)發(fā)的引物集非常易于使用，完全能滿(mǎn)足擴(kuò)增子捕獲探針制備的要求。

圖2. 六個(gè)后生動(dòng)物類(lèi)群(十足目、腹足綱、脊椎動(dòng)物亞門(mén)、蜘蛛目、異翅亞目、鱗翅目)引物集的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果

擴(kuò)增子捕獲與近年來(lái)廣泛采用的基于商業(yè)合成探針的AHE、UCE捕獲測(cè)序相比，在探針制備成本、探針制備周期、捕獲片段的平均長(zhǎng)度上均有明顯優(yōu)勢(shì)（表1）。Uprimer引物自動(dòng)化開(kāi)發(fā)功能的實(shí)現(xiàn)，讓非生物信息學(xué)專(zhuān)家也能輕松地通過(guò)基因組分析獲取所需的通用引物集，進(jìn)而借助擴(kuò)增子捕獲以低成本、快速、便捷的方式獲取基因組級(jí)別的分子數(shù)據(jù)。隨著更多類(lèi)群通用性引物集被開(kāi)發(fā)出來(lái)，擴(kuò)增子捕獲在未來(lái)的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究中將具有廣泛的應(yīng)用前景。

表1. 擴(kuò)增子探針與商業(yè)合成AHE、UCE探針的比較

（以分析100個(gè)鱗翅目物種，收集200 Kb的數(shù)據(jù)為例）

近日，該成果以“UPrimer: A Clade-Specific Primer Design Program Based on Nested PCR Strategy and Its Applications in Amplicon Capture Phylogenomics”為題發(fā)表在國(guó)際進(jìn)化生物學(xué)的權(quán)威期刊Molecular Biology and Evolution上。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張鵬教授和梁丹副教授為該項(xiàng)工作的共同通訊作者，原博士后李佳璇 (現(xiàn)于暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院工作) 為該文第一作者。此項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資助。

論文鏈接：https://academic.oup.com/mbe/article/40/11/msad230/7313555