中大新聞網(wǎng)訊（通訊員謝國(guó)友）N1-甲基腺嘌呤（m1A）是RNA轉(zhuǎn)錄后的一種重要修飾，通過(guò)在腺苷酸的N1位添加甲基而形成。RNA m1A甲基化修飾被發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)60年代，過(guò)去認(rèn)為m1A甲基化主要發(fā)生在rRNA和tRNA，參與RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持并影響蛋白翻譯效率。近年來(lái)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)m1A修飾同樣存在于mRNA。其可干擾Watson-Crick堿基配對(duì)原則，表明m1A修飾的重要調(diào)節(jié)作用。然而，目前對(duì)于mRNA m1A修飾的生物學(xué)功能研究尚處于起步階段。
近日，中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝教授課題組在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(PNAS)以研究長(zhǎng)文形式發(fā)表了題為“RNA m1A methylation regulates glycolysis of cancer cells through modulating ATP5D”的研究論文（direct submission），發(fā)現(xiàn)m1A可通過(guò)調(diào)控線(xiàn)粒體ATP合酶F1結(jié)構(gòu)域中δ亞基的組成部分ATP5D的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞糖酵解水平。m1A通過(guò)介導(dǎo)形成YTHDF1/eRF1/mRNA復(fù)合物抑制ATP5D的翻譯，同時(shí)通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)負(fù)向調(diào)控ATP5D mRNA的穩(wěn)定性。利用dm1ACRISPR系統(tǒng)靶向去除ATP5D m1A修飾則上調(diào)ATP5D表達(dá)，從而引起腫瘤細(xì)胞糖酵解水平升高。這些結(jié)果揭示了mRNA m1A修飾與腫瘤代謝之間的調(diào)控關(guān)系，為腫瘤的治療提供了潛在的干預(yù)策略。
能量代謝是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本特征之一，細(xì)胞能量代謝的重編程在腫瘤相關(guān)研究中日益受到關(guān)注。能量代謝作為腫瘤細(xì)胞的重要標(biāo)志，Warburg效應(yīng)指出不管氧氣是否存在，癌細(xì)胞都能最大限度依賴(lài)糖酵解來(lái)獲取能量。該團(tuán)隊(duì)首先使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及shRNA敲低m1A去甲化酶ALKBH3以構(gòu)建m1A高水平腫瘤細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)ALKBH3敲低腫瘤細(xì)胞葡萄糖消耗、乳酸生成、ATP水平及胞外酸化率（ECAR）顯著降低，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染ALKBH3 m1A去甲基化酶活性位點(diǎn)突變質(zhì)粒A3-R122S、A3-L177A確認(rèn)了以上生物學(xué)效應(yīng)由m1A介導(dǎo)，以上結(jié)果說(shuō)明m1A參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝。
為了探討m1A調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝機(jī)制，該課題組通過(guò)mRNA-seq、m1A-seq及前期報(bào)道的m1A修飾的mRNA，發(fā)現(xiàn)m1A可能是通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵基因ATP5D的表達(dá)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞能量代謝，ATP5D是線(xiàn)粒體ATP合酶F1結(jié)構(gòu)域中δ亞基的組成部分，通過(guò)耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)催化ATP的合成。m1A-qPCR及ATP5D補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了ATP5D在m1A調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)m1A在轉(zhuǎn)錄及翻譯層面調(diào)控ATP5D mRNA的生物學(xué)行為。利用ChIPBase、PROMO及JASPAR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、ChIP-qPCR及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)m1A調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子E2F1通過(guò)結(jié)合ATP5D啟動(dòng)子-30～-23區(qū)域調(diào)控ATP5D的轉(zhuǎn)錄。
進(jìn)一步，該課題組利用Co-IP、CLIP-PCR及Ribo-seq實(shí)驗(yàn)鑒定出ATP5D m1A的識(shí)別效應(yīng)蛋白為YTHDF1，它通過(guò)招募真核生物翻譯終止因子eRF1形成YTHDF1/eRF1復(fù)合物增強(qiáng)翻譯終止效率，從而抑制ATP5D的翻譯。為解析m1A抑制ATP5D mRNA翻譯的具體修飾位點(diǎn)，RNA fragmentation及m1A-qPCR首先鑒定出ATP5D的m1A修飾位點(diǎn)位于其CDS區(qū)域的1號(hào)外顯子上（Exon1）。課題組結(jié)合ATP5D Exon1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其中附近CG含量高的A（A53、A71、A105/106/109/111、A136）進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)m1A-71可能為調(diào)控ATP5D mRNA 翻譯的關(guān)鍵性修飾位點(diǎn)。隨后利用選擇性去除m1A甲基化修飾工具dm1ACRISPR擦除A71的m1A，結(jié)果顯示ATP5D翻譯效率顯著升高，YTHDF1與eRF1之間的結(jié)合減少且腫瘤細(xì)胞葡糖糖消耗、乳酸生成及ATP生成增加，提示ATP5D Exon1區(qū)域的m1A-71是m1A調(diào)控ATP5D mRNA翻譯及介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞能量代謝過(guò)程的關(guān)鍵甲基化位點(diǎn)。
圖1. m1A調(diào)控ATP5D轉(zhuǎn)錄及翻譯分子機(jī)制模式圖
研究進(jìn)一步探討體內(nèi)外m1A/ATP5D對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響，發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低及對(duì)阿霉素（DOX）、順鉑（CDDP）等化療藥物的敏感性降低。當(dāng)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ATP5D，上述效應(yīng)則被逆轉(zhuǎn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明敲低ALKBH3則顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，以及降低腫瘤組織中ATP5D的表達(dá)，但ATP5D過(guò)表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)上述作用。臨床分析發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，ALKBH3及ATP5D在癌組織中表達(dá)顯著升高，且在癌組織中二者表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（P=0.044），ALKBH3或ATP5D表達(dá)水平高的患者有著更差的總生存期。
本研究深入解析了m1A調(diào)控ATP5D轉(zhuǎn)錄及翻譯的表觀(guān)遺傳機(jī)制，揭示了mRNA m1A修飾與腫瘤細(xì)胞能量代謝之間的調(diào)控關(guān)系，拓寬了對(duì)m1A調(diào)控mRNA生物學(xué)行為相關(guān)研究的認(rèn)知，并為基于mRNA m1A修飾腫瘤干預(yù)策略提供了理論依據(jù)及作用靶點(diǎn)。吳映敏、陳卓佳、謝國(guó)友為論文共同第一作者，王紅勝為論文獨(dú)立通訊作者。上述研究工作獲得國(guó)家自然科學(xué)基金等多項(xiàng)基金的資助及中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院陳麗昆教授、南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院牛紅心教授、北京大學(xué)伊成器教授等課題組的支持和幫助。
論文鏈接：https://www.pnas.org/eprint/GQPCDX5DEPHAME33MKXF/full
