創(chuàng)傷性脊髓損傷可導(dǎo)致脊髓組織缺損，損傷處的惡劣微環(huán)境給脊髓組織的再生以及移植細(xì)胞的存活帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。從在脊髓損傷處移植胚胎脊髓組織起至今近三十多年來(lái)，通過(guò)其中的胚胎脊髓神經(jīng)元去替換死亡的脊髓神經(jīng)元，在損傷/移植處形成神經(jīng)元中繼器(neuronal relay)修復(fù)脊髓損傷的理念逐漸形成，并得到了驗(yàn)證。然而，胚胎脊髓組織移植受到倫理學(xué)限制、移植物不易獲取等多方限制，不符合臨床轉(zhuǎn)化的要求。如何有效地在體外應(yīng)用細(xì)胞因子、生物材料和干細(xì)胞等組織工程新技術(shù)構(gòu)建類(lèi)似胚胎脊髓的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織是研究者們攻堅(jiān)克難的關(guān)鍵所在。
近日，我校中山醫(yī)學(xué)院曾園山教授團(tuán)隊(duì)研究揭示——基于胚胎脊髓發(fā)育生物信息學(xué)篩選出關(guān)鍵分子神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3 (NT-3)，利用緩釋技術(shù)，誘導(dǎo)表達(dá)其酪氨酸激酶受體C(TrkC)的神經(jīng)干細(xì)胞在三維支架材料中自組織(self-organization)發(fā)育為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。此組織工程產(chǎn)品移植到脊髓全橫斷大鼠后能與宿主神經(jīng)環(huán)路功能性整合。這一治療策略為構(gòu)建微環(huán)境優(yōu)化的干細(xì)胞源性組織工程神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織修復(fù)中樞神經(jīng)損傷提供了新思路。2021年4月8日，曾園山教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際TOP期刊Bioactive Materials (中科院一區(qū)，IF=8.724)上在線(xiàn)發(fā)表了題為“An NT-3-releasing bioscaffold supports the formation of TrkC-modified neural stem cell-derived neural network tissue with efficacy in repairing spinal cord injury”的研究成果。
圖：緩釋NT-3三維微環(huán)境支持神經(jīng)干細(xì)胞自組織發(fā)育為具有修復(fù)全橫斷脊髓損傷用途的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。A:胚胎脊髓發(fā)育的單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示，由神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Ntf3(NT-3)特異表達(dá)在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，而其受體Ntrk3(TrkC)不僅在祖細(xì)胞中表達(dá)，而且在各類(lèi)神經(jīng)元中廣泛表達(dá). B:免疫電鏡顯示支架材料表面有膠體金標(biāo)記的NT-3蛋白. C:示仿生脊髓形態(tài)的圓柱體緩釋支架形貌. D:示體外自組織神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中神經(jīng)元的動(dòng)作電位. E:在這些神經(jīng)元中可檢測(cè)到自發(fā)的興奮性突觸后電流. F:免疫電鏡顯示移植的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織中少突膠質(zhì)細(xì)胞形成髓鞘包裹神經(jīng)纖維. G:免疫電鏡顯示移植的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織中表達(dá)TrkC的神經(jīng)元形成突觸結(jié)構(gòu). H:示意NT-3緩釋生物復(fù)合物誘導(dǎo)TrkC修飾的NSC源性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織的形成，將其移植到大鼠全橫斷脊髓損傷區(qū)起到組織工程神經(jīng)元中繼器作用，與宿主脊髓組織功能性整合。
在胚胎脊髓發(fā)育過(guò)程中，其神經(jīng)元發(fā)生的機(jī)制涉及特定配體和受體之間相互作用，這有助于指導(dǎo)用于移植修復(fù)全橫斷脊髓損傷結(jié)構(gòu)和功能的組織工程神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織的構(gòu)建。本研究通過(guò)解析胚胎脊髓單細(xì)胞圖譜，發(fā)現(xiàn)NT-3及其受體TrkC在發(fā)育中的脊髓神經(jīng)元發(fā)生及其成熟過(guò)程中起重要作用。隨后，設(shè)計(jì)了一種配體-受體反應(yīng)性的方法來(lái)促進(jìn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自組織形成。通過(guò)將TrkC高表達(dá)的NSCs種植于NT-3釋放三維支架中，使其在NT-3富集的微環(huán)境中分化為具有成熟表型和電生理功能的神經(jīng)元。重要的是，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，外源性NT-3與來(lái)自干細(xì)胞自分泌的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)(如層粘連蛋白等)在一起創(chuàng)造了一種獨(dú)特的生態(tài)位(ecological niche)。這樣的營(yíng)養(yǎng)因子、干細(xì)胞自分泌的生長(zhǎng)因子以及沉積在支架上的細(xì)胞外基質(zhì)之間動(dòng)態(tài)整合，促使組織樣組裝，最終形成具有傳遞興奮性信息功能的神經(jīng)元、具有髓鞘形成潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少量干細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植到大鼠脊髓全橫斷2 毫米缺損區(qū)，可觀(guān)察到這種含有生態(tài)位的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織在損傷/移植區(qū)能存活較長(zhǎng)時(shí)間，維持相關(guān)細(xì)胞的分化表型，并形成突觸及髓鞘結(jié)構(gòu)。此外，宿主神經(jīng)纖維再生進(jìn)入脊髓損傷/移植區(qū)與移植的NSC源性神經(jīng)元形成突觸樣結(jié)構(gòu)，促進(jìn)大鼠癱瘓后肢運(yùn)動(dòng)功能的改善。
本研究聚焦于改善脊髓損傷區(qū)微環(huán)境和重建脊髓神經(jīng)環(huán)路的需求，率先模擬胚胎發(fā)育過(guò)程中配體/受體間的誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生機(jī)制，對(duì)種子細(xì)胞、生物活性因子、生物支架材料和組織化培養(yǎng)時(shí)間這四種要素進(jìn)行組織工程化設(shè)計(jì)，通過(guò)優(yōu)化生物材料及修飾干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的工程化誘導(dǎo)，滿(mǎn)足高效的組織工程化構(gòu)建生物組織的需求。應(yīng)用組織工程神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植還可以避免采用干細(xì)胞直接移植在脊髓損傷區(qū)的分化不確定性、異常增殖和異位遷移的風(fēng)險(xiǎn)，為脊髓損傷修復(fù)提供了新的治療方案。
該論文第一作者為我校中山醫(yī)學(xué)院副研究員李戈博士，中山醫(yī)學(xué)院曾園山教授為通訊作者，曾湘研究員為共同通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委重大項(xiàng)目課題、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目和廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目的資助。
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